uutiset

Viimeisen vuosikymmenen aikana geenisekvensointiteknologiaa on käytetty laajalti syöpätutkimuksessa ja kliinisessä käytännössä, ja siitä on tullut tärkeä työkalu syövän molekyylitason ominaisuuksien paljastamiseen. Molekyylidiagnostiikan ja kohdennetun hoidon kehitys on edistänyt kasvainten täsmähoitokonseptien kehitystä ja tuonut suuria muutoksia koko kasvainten diagnostiikan ja hoidon alalle. Geenitestausta voidaan käyttää syöpäriskin varoittamiseen, hoitopäätösten ohjaamiseen ja ennusteen arviointiin, ja se on tärkeä työkalu potilaiden kliinisten tulosten parantamiseen. Tässä yhteenvedossa esittelemme CA Cancer J Clin-, JCO- ja Ann Oncol -lehdissä sekä muissa lehdissä julkaistuja viimeaikaisia ​​artikkeleita, joissa tarkastellaan geneettisen testauksen soveltamista syövän diagnostiikassa ja hoidossa.

Somaattiset mutaatiot ja ituradan mutaatiot. Yleisesti ottaen syövän aiheuttavat DNA-mutaatiot, jotka voivat periä vanhemmilta (ituradan mutaatiot) tai hankkia iän myötä (somaattiset mutaatiot). Sukuradan mutaatioita esiintyy syntymästä lähtien, ja mutatoija kantaa yleensä mutaatiota jokaisen kehon solun DNA:ssa ja voi siirtyä jälkeläisille. Somaattisia mutaatioita hankkivat yksilöt muissa kuin sukusoluissa, eivätkä ne yleensä siirry jälkeläisille. Sekä ituradan että somaattiset mutaatiot voivat tuhota solujen normaalin toiminnallisen aktiivisuuden ja johtaa solujen pahanlaatuiseen transformaatioon. Somaattiset mutaatiot ovat keskeinen pahanlaatuisuuden ajuri ja ennustavin biomarkkeri onkologiassa; kuitenkin noin 10–20 prosentilla kasvainpotilaista on ituradan mutaatioita, jotka lisäävät merkittävästi heidän syöpäriskiään, ja jotkut näistä mutaatioista ovat myös terapeuttisia.
Ohjainmutaatio ja matkustajamutaatio. Kaikki DNA-variantit eivät vaikuta solun toimintaan; keskimäärin tarvitaan viidestä kymmeneen genomista tapahtumaa, jotka tunnetaan nimellä "kuljettajamutaatiot", käynnistämään normaali solun rappeutuminen. Ohjainmutaatioita esiintyy usein geeneissä, jotka liittyvät läheisesti solun elintoimintoihin, kuten geeneissä, jotka osallistuvat solujen kasvun säätelyyn, DNA:n korjaukseen, solusyklin säätelyyn ja muihin elintoimintoihin, ja niitä voidaan mahdollisesti käyttää terapeuttisina kohteina. Mutaatioiden kokonaismäärä missä tahansa syövässä on kuitenkin melko suuri, vaihdellen muutamasta tuhannesta joissakin rintasyövissä yli 100 000:een joissakin erittäin vaihtelevissa kolorektaalisyövissä ja endometriumin syövissä. Useimmilla mutaatioilla ei ole lainkaan tai on vain vähän biologista merkitystä, vaikka mutaatio tapahtuisi koodaavalla alueella, tällaisia ​​merkityksettömiä mutaatiotapahtumia kutsutaan "matkustajamutaatioiksi". Jos tietyn kasvaintyypin geenivariantti ennustaa sen vasteen tai resistenssin hoidolle, varianttia pidetään kliinisesti toimivana.
Onkogeenit ja kasvainsuppressorigeenit. Syövässä usein mutatoituvat geenit voidaan karkeasti jakaa kahteen luokkaan: onkogeeneihin ja kasvainsuppressorigeeneihin. Normaaleissa soluissa onkogeenien koodaaman proteiinin pääasiallinen tehtävä on edistää solujen lisääntymistä ja estää solujen apoptoosia, kun taas onkosuppressorigeenien koodaama proteiini on pääasiassa vastuussa solujen jakautumisen negatiivisesta säätelystä normaalin solutoiminnan ylläpitämiseksi. Pahanlaatuisessa transformaatioprosessissa genomin mutaatio johtaa onkogeeniaktiivisuuden lisääntymiseen ja onkosuppressorigeeniaktiivisuuden vähenemiseen tai häviämiseen.
Pieni variaatio ja rakenteellinen variaatio. Nämä ovat genomin kaksi pääasiallista mutaatiotyyppiä. Pienet variantit muuttavat DNA:ta muuttamalla, poistamalla tai lisäämällä pienen määrän emäksiä, mukaan lukien emäsinsertio, deleetio, lukukehyksen muutos, aloituskodonin menetys, lopetuskodonin menetysmutaatio jne. Rakenteellinen variaatio on suuri genomin uudelleenjärjestely, johon liittyy geenisegmenttejä, joiden koko vaihtelee muutamasta tuhannesta emäksestä suurimpaan osaan kromosomia, mukaan lukien geenikopioiden määrän muutokset, kromosomin deleetio, duplikaatio, inversio tai translokaatio. Nämä mutaatiot voivat aiheuttaa proteiinin toiminnan heikkenemistä tai tehostumista. Yksittäisten geenien tasolla tapahtuvien muutosten lisäksi genomiset signatuurit ovat myös osa kliinisiä sekvensointiraportteja. Genomisia signatuureja voidaan pitää monimutkaisina pienten ja/tai rakenteellisten variaatioiden kuvioina, mukaan lukien kasvainmutaatiokuorma (TMB), mikrosatelliittien epävakaus (MSI) ja homologiset rekombinaatiovirheet.

Klonaalinen mutaatio ja subklonaalinen mutaatio. Klonaalisia mutaatioita esiintyy kaikissa kasvainsoluissa, niitä esiintyy diagnoosin teon yhteydessä ja ne pysyvät läsnä hoidon edetessä. Siksi klonaalisia mutaatioita voidaan käyttää kasvainten terapeuttisina kohteina. Subklonaalisia mutaatioita esiintyy vain osassa syöpäsoluja, ja ne voidaan havaita diagnoosin alussa, mutta ne häviävät myöhemmän uusiutumisen myötä tai ilmestyvät vasta hoidon jälkeen. Syövän heterogeenisuus viittaa useiden subklonaalisten mutaatioiden esiintymiseen yhdessä syövässä. Merkillepantavaa on, että valtaosa kliinisesti merkittävistä ajurimutaatioista kaikissa yleisissä syöpälajeissa on klonaalisia mutaatioita ja pysyvät vakaina koko syövän etenemisen ajan. Resistenssiä, jota usein välittävät subkloonit, ei välttämättä havaita diagnoosin teon yhteydessä, mutta se ilmenee, kun tauti uusiutuu hoidon jälkeen.

Perinteistä FISH-tekniikkaa eli solukaryotyypitystä käytetään kromosomitason muutosten havaitsemiseen. FISH-menetelmällä voidaan havaita geenifuusioita, deleetioita ja amplifikaatioita, ja sitä pidetään "kultaisena standardina" tällaisten varianttien havaitsemisessa, sillä sillä on korkea tarkkuus ja herkkyys, mutta rajallinen läpimenoaika. Joissakin hematologisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, erityisesti akuutissa leukemiassa, karyotyypitystä käytetään edelleen diagnoosin ja ennusteen ohjaamiseen, mutta tätä tekniikkaa korvataan vähitellen kohdennetuilla molekyylimäärityksillä, kuten FISH, WGS ja NGS.
Yksittäisten geenien muutoksia voidaan havaita PCR:llä, sekä reaaliaikaisella PCR:llä että digitaalisella pisara-PCR:llä. Näillä tekniikoilla on korkea herkkyys, ne soveltuvat erityisesti pienten jäännösvaurioiden havaitsemiseen ja seurantaan, ja niillä voidaan saada tuloksia suhteellisen lyhyessä ajassa. Haittapuolena on, että havaitsemisalue on rajallinen (yleensä mutaatiot havaitaan vain yhdessä tai muutamassa geenissä), ja useiden testien mahdollisuudet ovat rajalliset.
Immunohistokemia (IHC) on proteiinipohjainen seurantatyökalu, jota käytetään yleisesti biomarkkereiden, kuten ERBB2:n (HER2) ja estrogeenireseptorien, ilmentymisen havaitsemiseen. IHC:tä voidaan käyttää myös tiettyjen mutatoituneiden proteiinien (kuten BRAF V600E) ja tiettyjen geenifuusioiden (kuten ALK-fuusioiden) havaitsemiseen. IHC:n etuna on, että se voidaan helposti integroida rutiininomaiseen kudosanalyysiprosessiin, joten se voidaan yhdistää muihin testeihin. Lisäksi IHC voi tarjota tietoa proteiinien solunsisäisestä lokalisaatiosta. Haittoja ovat rajallinen skaalautuvuus ja korkeat organisatoriset vaatimukset.
Toisen sukupolven sekvensointi (NGS) NGS käyttää tehokkaita rinnakkaissekvensointitekniikoita DNA- ja/tai RNA-tason variaatioiden havaitsemiseen. Tätä tekniikkaa voidaan käyttää sekä koko genomin (WGS) että kiinnostuksen kohteena olevien geenialueiden sekvensointiin. WGS tarjoaa kattavimmat tiedot genomisista mutaatioista, mutta sen kliiniselle sovellukselle on monia esteitä, mukaan lukien tuoreiden kasvainkudosnäytteiden tarve (WGS ei vielä sovellu formaliinilla immobilisoitujen näytteiden analysointiin) ja korkeat kustannukset.
Kohdennettu NGS-sekvensointi sisältää koko eksonin sekvensoinnin ja kohdegeenipaneelin. Nämä testit rikastavat kiinnostuksen kohteena olevia alueita DNA-koettimilla tai PCR-amplifikaatiolla, mikä rajoittaa tarvittavan sekvensoinnin määrää (koko eksomi muodostaa 1–2 prosenttia genomista, ja jopa suuret paneelit, jotka sisältävät 500 geeniä, muodostavat vain 0,1 prosenttia genomista). Vaikka koko eksonin sekvensointi toimii hyvin formaliinifiksoiduissa kudoksissa, sen kustannukset ovat edelleen korkeat. Kohdegeeniyhdistelmät ovat suhteellisen taloudellisia ja mahdollistavat joustavuutta testattavien geenien valinnassa. Lisäksi kiertävä vapaa DNA (cfDNA) on nousemassa uudeksi vaihtoehdoksi syöpäpotilaiden genomianalyysiin, joka tunnetaan nestemäisinä biopsioina. Sekä syöpäsolut että normaalit solut voivat vapauttaa DNA:ta verenkiertoon, ja syöpäsoluista irronnutta DNA:ta kutsutaan kiertäväksi kasvain-DNA:ksi (ctDNA), jota voidaan analysoida mahdollisten mutaatioiden havaitsemiseksi kasvainsoluissa.
Testin valinta riippuu käsiteltävästä kliinisestä ongelmasta. Useimmat hyväksyttyihin hoitoihin liittyvät biomarkkerit voidaan havaita FISH-, IHC- ja PCR-tekniikoilla. Nämä menetelmät ovat kohtuullisia pienten biomarkkerimäärien havaitsemiseen, mutta ne eivät paranna havaitsemisen tehokkuutta kasvaessa läpimenon, ja jos havaitaan liikaa biomarkkereita, kudosta ei välttämättä ole riittävästi havaitsemiseen. Joissakin tietyissä syöpätyypeissä, kuten keuhkosyövässä, joissa kudosnäytteitä on vaikea saada ja testattavia biomarkkereita on useita, NGS:n käyttö on parempi vaihtoehto. Yhteenvetona voidaan todeta, että määritysmenetelmän valinta riippuu kullekin potilaalle testattavien biomarkkereiden määrästä ja biomarkkeria testattavien potilaiden määrästä. Joissakin tapauksissa IHC/FISH:n käyttö riittää, varsinkin kun kohde on tunnistettu, kuten estrogeenireseptorien, progesteronireseptorien ja ERBB2:n havaitseminen rintasyöpäpotilailla. Jos tarvitaan kattavampaa genomimutaatioiden selvittämistä ja mahdollisten terapeuttisten kohteiden etsimistä, NGS on järjestelmällisempi ja kustannustehokkaampi. Lisäksi NGS:ää voidaan harkita tapauksissa, joissa IHC/FISH-tulokset ovat epäselviä tai epäselviä.

Erilaiset ohjeet antavat ohjeita siitä, mitkä potilaat olisivat oikeutettuja geenitestaukseen. Vuonna 2020 ESMO:n tarkkuuslääketieteen työryhmä julkaisi ensimmäiset NGS-testaussuositukset pitkälle edenneen syövän potilaille ja suositteli rutiininomaista NGS-testausta pitkälle edenneen ei-levyepiteeliperäisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän, eturauhassyövän, paksusuolen syövän, sappitiehyen syövän ja munasarjasyövän kasvainnäytteille. Vuonna 2024 ESMO päivitti suositusta tältä pohjalta suosittelemalla rintasyövän ja harvinaisten kasvainten, kuten maha-suolikanavan stroomakasvainten, sarkoomien, kilpirauhassyöpien ja tuntemattomasta syystä peräisin olevien syöpien, sisällyttämistä tutkimukseen.
Vuonna 2022 ASCO:n kliininen lausunto somaattisesta genomitestauksesta metastaattista tai pitkälle edennyttä syöpää sairastavilla potilailla toteaa, että jos biomarkkeriin liittyvä hoito hyväksytään potilaille, joilla on metastaattinen tai pitkälle edennyt kiinteä kasvain, näille potilaille suositellaan geenitestausta. Esimerkiksi genomitestaus tulisi suorittaa potilaille, joilla on metastaattinen melanooma, BRAF V600E -mutaatioiden seulomiseksi, koska RAF- ja MEK-estäjät on hyväksytty tähän käyttöaiheeseen. Lisäksi geenitestaus tulisi suorittaa myös silloin, jos potilaalle annettavalle lääkkeelle on selkeä resistenssimerkki. Esimerkiksi egfrmab on tehoton KRAS-mutatoituneessa kolorektaalisyövässä. Harkittaessa potilaan soveltuvuutta geenisekvensointiin, potilaan fyysinen tila, liitännäissairaudet ja kasvaimen vaihe tulisi integroida, koska genomisekvensointiin vaadittavat vaiheet, mukaan lukien potilaan suostumus, laboratoriokäsittely ja sekvensointitulosten analysointi, edellyttävät potilaalta riittävää fyysistä toimintakykyä ja elinajanodottetta.
Somaattisten mutaatioiden lisäksi joitakin syöpiä tulisi testata myös sukusolujen geenien varalta. Sukusolujen mutaatioiden testaaminen voi vaikuttaa hoitopäätöksiin syöpien, kuten BRCA1- ja BRCA2-mutaatioiden, hoidossa rinta-, munasarja-, eturauhas- ja haimasyövissä. Sukusolujen mutaatioilla voi olla merkitystä myös potilaiden tulevalle syövän seulonnalle ja ehkäisylle. Potilaiden, jotka mahdollisesti soveltuvat sukusolujen mutaatioiden testaukseen, on täytettävä tietyt ehdot, joihin kuuluvat tekijät, kuten syövän esiintyminen suvussa, ikä diagnoosin tekohetkellä ja syövän tyyppi. Monet potilaat (jopa 50 %), joilla on patogeenisiä mutaatioita sukusolulinjassa, eivät kuitenkaan täytä perinteisiä sukusolujen mutaatioiden testauskriteerejä, jotka perustuvat sukusolujen historiaan. Siksi National Comprehensive Cancer Network (NCCN) suosittelee, että kaikki tai useimmat rinta-, munasarja-, kohdun limakalvo-, haima-, paksusuolen- tai eturauhassyöpää sairastavat potilaat testataan sukusolujen mutaatioiden varalta, jotta mutaatioiden kantajat voidaan tunnistaa mahdollisimman tehokkaasti.
Geneettisten testien ajoituksen osalta on järkevää suorittaa geenitestaus potilaille jo pitkälle edenneen syövän diagnoosin yhteydessä, koska valtaosa kliinisesti merkittävistä ajurimutaatioista on klonaalisia ja suhteellisen pysyviä syövän etenemisen aikana. Myöhemmissä geneettisissä testeissä, erityisesti molekyylikohdennetun hoidon jälkeen, ctDNA-testaus on edullisempaa kuin kasvainkudoksen DNA:n testaus, koska veren DNA voi sisältää DNA:ta kaikista kasvainleesioista, mikä on suotuisampaa tiedon saamiseksi kasvaimen heterogeenisyydestä.
Hoidon jälkeinen ctDNA:n analysointi voi pystyä ennustamaan kasvaimen vastetta hoitoon ja tunnistamaan taudin etenemisen aikaisemmin kuin tavanomaiset kuvantamismenetelmät. Näiden tietojen käyttämiseksi hoitopäätösten ohjaamiseen ei kuitenkaan ole vahvistettu protokollia, eikä ctDNA-analyysiä suositella, ellei sitä tehdä kliinisissä tutkimuksissa. ctDNA:ta voidaan käyttää myös pienten jäännösvaurioiden arviointiin radikaalin kasvainleikkauksen jälkeen. Leikkauksen jälkeinen ctDNA-testaus on vahva ennustaja taudin myöhemmälle etenemiselle ja voi auttaa määrittämään, hyötyykö potilas adjuvanttisesta kemoterapiasta, mutta ctDNA:n käyttöä adjuvanttisen kemoterapian päätösten ohjaamiseen kliinisten tutkimusten ulkopuolella ei vieläkään suositella.

Tiedonkäsittely Ensimmäinen vaihe genomisekvensoinnissa on DNA:n eristäminen potilasnäytteistä, kirjastojen valmistelu ja raakasekvensointidatan luominen. Raakadatan jatkokäsittelyä tarvitaan, mukaan lukien heikkolaatuisen datan suodattaminen, sen vertaaminen referenssigenomiin, erityyppisten mutaatioiden tunnistaminen erilaisten analyyttisten algoritmien avulla, näiden mutaatioiden vaikutuksen määrittäminen proteiinin translaatioon ja sukusolujen solulinjan mutaatioiden suodattaminen.
Ohjaingeenin annotaatio on suunniteltu erottamaan kuljettaja- ja matkustajamutaatiot. Ohjainmutaatiot johtavat kasvainsuppressorigeenin aktiivisuuden menetykseen tai tehostumiseen. Pieniä variantteja, jotka johtavat kasvainsuppressorigeenien inaktivoitumiseen, ovat nonsense-mutaatiot, lukukehyksen muutosmutaatiot ja keskeiset silmukointikohdan mutaatiot, samoin kuin harvemmin esiintyvät aloituskodonin deleetiot, lopetuskodonin deleetiot ja laaja valikoima intronin insertio-/deleetiomutaatioita. Lisäksi missense-mutaatiot ja pienet intronin insertio-/deleetiomutaatiot voivat myös johtaa kasvainsuppressorigeenin aktiivisuuden menetykseen, kun ne vaikuttavat tärkeisiin toiminnallisiin domeeneihin. Rakenteellisia variantteja, jotka johtavat kasvainsuppressorigeenin aktiivisuuden menetykseen, ovat osittainen tai täydellinen geenin deleetio ja muut genomiset variantit, jotka johtavat geenin lukukehyksen tuhoutumiseen. Pieniä variantteja, jotka johtavat onkogeenien tehostumiseen, ovat missense-mutaatiot ja satunnaiset intronien insertiot/deleetiot, jotka kohdistuvat tärkeisiin proteiinien toiminnallisiin domeeneihin. Harvinaisissa tapauksissa proteiinin katkaisu- tai silmukointikohdan mutaatiot voivat johtaa onkogeenien aktivoitumiseen. Onkogeenien aktivoitumiseen johtavia rakenteellisia variaatioita ovat geenifuusio, geenien deleetio ja geenien duplikaatio.
Genomisen variaation kliininen tulkinta arvioi tunnistettujen mutaatioiden kliinistä merkitystä eli niiden mahdollista diagnostista, prognostista tai terapeuttista arvoa. Genomisen variaation kliinistä tulkintaa voidaan ohjata useilla näyttöön perustuvilla luokitusjärjestelmillä.
Memorial Sloan-Kettering Cancer Centerin Precision Medicine Oncology Database (OncoKB) luokittelee geenivariantit neljään tasoon niiden lääkkeenkäytön ennustearvon perusteella: Taso 1/2, FDA:n hyväksymät eli kliinisesti standardin mukaiset biomarkkerit, jotka ennustavat tietyn käyttöaiheen vasteen hyväksyttyyn lääkkeeseen; Taso 3, FDA:n hyväksymät tai hyväksymättömät biomarkkerit, jotka ennustavat vastetta uusille kohdennetuille lääkkeille, jotka ovat osoittaneet lupaavia kliinisissä tutkimuksissa, ja Taso 4, FDA:n hyväksymättömät biomarkkerit, jotka ennustavat vastetta uusille kohdennetuille lääkkeille, jotka ovat osoittaneet vakuuttavaa biologista näyttöä kliinisissä tutkimuksissa. Lisättiin viides alaryhmä, joka liittyy hoitoresistenssiin.
American Society for Molecular Pathology (AMP) / American Society of Clinical Oncology (ASCO) / College of American Pathologists (CAP) -järjestön somaattisen variaation tulkintaohjeet jakavat somaattisen variaation neljään luokkaan: aste I, jolla on vahva kliininen merkitys; aste II, jolla on potentiaalinen kliininen merkitys; aste III, kliininen merkitys tuntematon; aste IV, jonka kliininen merkitys ei tiedetä olevan merkittävä. Vain asteen I ja II variantit ovat arvokkaita hoitopäätöksiä varten.
ESMO:n molekyylikohteen kliinisen toimivuuden asteikko (ESCAT) luokittelee geenivariantit kuuteen tasoon: Taso I, rutiinikäyttöön soveltuvat kohteet; Vaihe II, kohde, jota vielä tutkitaan, on todennäköisesti tarkoitettu seulomaan potilaspopulaatiota, joka voisi hyötyä kohdelääkkeestä, mutta sen tueksi tarvitaan lisää tietoa. Luokka III, kohdennetut geenivariantit, jotka ovat osoittaneet kliinistä hyötyä muissa syöpälajeissa; Luokka IV, vain kohdennetut geenivariantit, joita tukee prekliininen näyttö; Luokassa V on näyttöä, joka tukee mutaation kohdentamisen kliinistä merkitystä, mutta kohdetta vastaan ​​​​tehty yksittäinen lääkehoito ei pidennä eloonjäämisaikaa tai voidaan ottaa käyttöön yhdistelmähoitostrategia; Luokka X, kliinisen arvon puute.